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百令胶囊对大鼠肾小管间质纤维化的防治作用

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人气:-发表时间:2016-07-05 14:47【

李暖 陈新德 杨达胜 赵德安 毕凌云

摘要目的:观察百令胶囊对肾小管间质纤维化的防治作用及其作用机制。方法:雄性SD大鼠90只,随机分为对Nd~(30只)、模型组(30只)、预NN(30只)。以2%腺嘌呤淀粉混悬液150mg·kg-1·d-1灌胃,连续17周,制作大鼠肾小管间质纤维化模型;预防组加以1.5g·kg-1·d-1百令胶囊溶于生理盐水灌胃以预防肾小管间质纤维化;对照组以等体积的2%淀粉溶液和生理盐水灌胃。分别于实验第7周、12周、17周时随机处死10只大鼠,进行血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN),24h尿蛋白定量和尿NAG酶检测,光镜下观察肾组织的病理变化,计算肾小管间质纤维化指数;免疫组织化学法检测肾脏HGF、TGF-β1的表达情况。结果:(1)功能学变化:与对照组比较,各时相点模型组、预防组大鼠尿蛋白、尿NAG酶、Scr及BUN均升高(P<0.01),但预防组低于模型组(P<0.01);模型组、预防组自身对照各指标均较前一时相点升高(P<0.01)。(2)病理学变化:7周时模型组、预防组即有肾小管问质损害;模型组、预防组自身对照肾小管问质损害均较前一时相点加重(P<0.01),但7周、12周时预防组肾小管间质损害均较模型组为轻(P<0.01),17周时两组间无统计学差异(p>0.05)。(3)免疫组化:模型组、预防组大鼠肾脏HGF表达7周、12周时高于对照组大鼠(P<0.01),17周时低于对照组(P<0.01),且各时相点预防组均高于模型组(P<0.01);模型组、预防组自身对照均较前一时相点降低(P<0.01),17周时表达量最低。各时相点模型组、预防组大鼠肾脏TGF-β1的表达均高于对照组(P<0.01),且预防组均低于模型组(P<0.01),模型组、预防组自身对照均较前一时相点升高(P<0.01),17周时表达量最高。(4)HGF表达量与TGF-β1表达量呈负相关(r=-0.999,P<0.01)。结论:百令胶囊对早期肾小管间质纤维化有一定的防治作用,随着病程的进展将失去其作用;其早期防治肾小管间质纤维化作用和诱导HGF高表达有关。

关键词】肾小管间质纤维化 肝细胞生长因子 转化生长因子-β 冬虫夏草

肾小管问质纤维化是肾脏疾病进展至终末期肾衰竭的共同病理表现。因而,对其发生、发展机制及其防治的研究越来越受到研究者的重视。本文旨在探讨应用中药百令胶囊防治肾小管纤维化机制,现报道如下。

材料与方法

1.动物模型 选用雄性3月龄SD大鼠90只,体重160~210g,购自郑州大学医学部动物试验中心。大鼠适应环境1周后,随机分为:对照组、模型组、预防组。每组各30只。方法,将腺嘌呤以2%淀粉溶液溶解,制成混悬液。以150mg·kg-1·d-1灌胃,连续17周,制作大鼠肾小管间质纤维化模型;预防组以150mg·kg-1·d-1灌胃,同时以1.5g·kg-1·d-1百令胶囊溶于生理盐水灌胃;对照组以腺嘌呤相同体积淀粉和百令胶囊相同体积生理盐水灌胃。分别于实验第7周、12周、17周时各组随机处死10只大鼠。取肾脏,10%多聚甲醛固定,光镜下观察肾组织的病理变化和免疫组织化学法检测肾脏HGF、TGF-β1的表达情况。处死前取血,并于各时相点前1d分别将各组10只大鼠放入代谢笼中留取24h尿液,进行生化指标检测。

2.生化指标检测 血清肌酐(Scr)和尿素氮(BUN)采用BECKMAN CX-7全自动生化分析仪测定;24h尿蛋白定量采用考马斯亮蓝法;尿NAG酶采用比色法。

3.肾脏组织病理 肾组织HE染色和Masson特染,光镜观察。在IDA-2000高清晰度数码显微图像分析系统下计算肾小管间质纤维化指数。高倍镜(×200)下随机选取10个不重叠视野测定小管间质纤维化面积与同视野小管间质总面积的百分比,进行半定量评分。评分标准:0分:无病变;1分:<25%;2分:26%~50%;3分:>50%。每张切片取10个视野的平均积分,再在各组取平均值。

4.免疫组化 采用SABC法检测肾组织中的HGF、TGF-β1,操作步骤按SABC试剂盒说明书进行。光镜下组织切片呈棕黄色颗粒性沉积区域为阳性染色部位。HGF、TGF-β1染色结果在高倍镜(×200)下随机选择20个不重叠的视野,采用半定量评分。HGF、TGF-β1半定量评分标准:0分:无染色;1分:染色面积<25%;2分:染色面积25%~50%;3分:染色面积50%~75%;4分:染色面积75%~100%。

5.统计学方法 各组数据均采用(x±S)表示,组间比较采用两组独立样本的t检验(双侧),指标间的关系采用二元变量的非参数Spearman等级相关性检验,由SPSS10.0统计软件进行统计学处理。

结 果

1.生化指标检测 与对照组比较,各时相点模型组、预防组大鼠尿蛋白、尿NAG酶、Scr及BUN均升高(P<0.01),但预防组低于模型组(P<0.01);模型组、预防组自身对照各指标均较前一时相点升高(P<0.01)。见表1。

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2.肾脏组织病理改变 各时期对照组大鼠肾脏无病理改变。模型组和预防组大鼠肾脏病理改变均呈加重趋势。实验7周时,模型组和预防组大鼠肾脏肾小管扩张,间质单核细胞浸润、水肿,可见间质纤维组织灶性增生。12周时,模型组和预防组肾小管扩张明显,肾小管上皮空泡或颗粒性变性,基底膜断裂,小管间质区.或增宽,纤维化明显。17周时,模型组和预防组两组大鼠肾脏病理检查均可见肾小管明显萎缩及消失,间质广泛纤维化。7周、12周时,预防组大鼠肾脏病理改变均较模型组轻。17周时,模型组和预防组大鼠肾脏病理改变无统计学差异(P>0.05)。模型组和预防组大鼠肾脏病理改变自身对照均较前一时相点加重。见表2。

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3.肾组织免疫组化变化

3.1 HGF的表达 正常对照组肾脏HGF表达量较少。模型组HGF表达量,7周时增加,阳性细胞主要为损伤的小管上皮细胞和间质细胞;12周时较7周时明显减少;17周时进一步减少,甚至低于正常对照组表达量。预防组HGF表达量,7周时也增加,且高于同时相点模型组;12周时下降,但仍高于同时相点模型组。17周时明显减少,低于正常对照组表达量,与同时相点模型组比较无统计学差异。

3.2 TGF-β1的表达 正常对照组肾间质偶见TGF-β1表达。模型组、预防组7周时TGF-β1表达已明显增多,随着时间的推移,病程进展,TGF-β1表达量进一步增加。7周、12周、17周各时相点预防组TGF-β1表达强度均低于模型组。见表3。

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4.相关性分析 在肾小管问质纤维化过程中,肾脏中HGF的表达与TGF-β1的表达呈负相关关系(r=-0.999,P<0.01)。

讨 论

本文采用腺嘌呤诱导大鼠肾小管问质纤维化模型,7周时即已出现肾功能改变,随着病程进展肾功能持续恶化,17周时肾功能明显减退,病理出现小管萎缩,间质纤维大量增生,具有典型的肾脏病理学损害和功能学改变,与楚非等报道相似。

本实验研究百令胶囊对大鼠肾小管问质纤维化早、中期的防治作用。百令胶囊是人工培养的冬虫夏草菌丝,经生物工程方法制成的中药制剂,它与天然虫草的化学组成与功效基本一致。用肾大部分切除术建立慢性肾衰竭(CRF)模型观察虫草对残余肾组织和肾功能的影响,提示虫草能延缓CRF大鼠的肾功能减退,减轻蛋白尿,纠正氨基酸、蛋白质和脂质代谢紊乱,抑制残余肾组织的肾小球硬化和肾小管问质损伤的发展。我们的结果提示百令胶囊治疗对肾小管上皮细胞有保护作用,能有效地改善大鼠的肾损害。

本实验显示,百令胶囊治疗可抑制大鼠肾脏TGF-β1表达,减轻肾小管间质纤维化。郭啸华等观察百令及其提取液对环孢素A(CsA)肾毒性的防治作用,也表明百令及其提取液能明显改善CsA肾中毒大鼠的肾小管损害,组织形态学证实,百令及其提取液能减少肾小管上皮细胞空泡变性和细胞坏死,减少问质炎性细胞浸润及间质纤维化,降低小血管的透明样变性的发生率;同时也抑制转化生长因子B在小血管的表达,减少纤维连接蛋白在球囊壁和血管的沉积。

肾脏纤维化不仅与TGF-β1表达增加有关,而且与HGF表达降低有关。内源性HGF可通过拮抗TGF-β1而发挥抗纤维化作用。我们的实验结果显示百令胶囊可以诱导HGF的表达,促使肾小管上皮细胞的增殖和修复。同时HGF又抑制TGF-β1的表达和单核细胞浸润,使TGF-β1表达减少,减轻纤维化程度。这可能是其抗肾小管间质纤维化的又一机制。我们的实验还显示病程的末期(第17周)预防组和模型组肾功能均减低,肾脏病理检查均可见肾小管明显萎缩及消失,问质广泛纤维化,两者之问无差异,提示百令胶囊可能在肾小管问质纤维化的早期对肾脏有保护作用,但随着肾脏病变的加重,将失去其作用。百令胶囊晚期失去其作用可能和病因持续存在有关。研究结果提示,药物防治肾小管间质纤维化应该早期应用,且消除可能导致肾小管问质纤维化的病因尤为重要。

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