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雷帕霉素和中药百令胶囊对大鼠小肠移植后细胞凋亡和FasLmRNA表达作用

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人气:-发表时间:2016-06-27 10:40【

何小玲 逯宁 刘彤 王鹏志

摘要 目的:观察雷帕霉素(RAPA)和中药百令胶囊对大鼠小肠移植后细胞凋亡和凋亡基因FasL表达的作用。方法:以SD大鼠为假移植组作对照(1组),采用Wistar→SD大鼠异位小肠移植模型根据不同处理分为排斥组、RAPA2mg/kg和RA2PA4mg/kg组以及RAPA2mg/kg加百令胶囊组,术后1、3、5、7d每组各取6只动物处死,获取移植肠组织进行病理学检查;取冰冻移植小肠标本行细胞凋亡的检测,采用QRT-PCR方法检测移植小肠标本FasLm RNA表达的情况。结果:排斥反应发生时出现大量的肠上皮细胞凋亡,RAPA4mg/kg可显著地抑制肠细胞凋亡的发生,而2mg/kg与中药百令胶囊1mg/kg联合应用于术后7d抑制凋亡的能力与RAPA4mg/kg组无显著性差异。结论:细胞凋亡是诊断小肠移植排斥反应的一个良好的指示剂,RAPA4mg/kg可显著抑制细胞凋亡及凋亡基因FasL mRNA的表达,RAPA2mg/kg加百令胶囊虽可显著抑制细胞凋亡,但对FasL mRNA的表达无抑制作用。RAPA2mg/kg加百令胶囊联合应用对于抑制大鼠小肠移植排斥反应,抑制细胞凋亡具有相加或协同作用。

关键词 小肠/移植 排斥反应 细胞凋亡 雷帕霉素

在器官移植领域中,长期应用免疫抑制剂可引发多种感染和淋巴系统肿瘤,且常用的环孢素A和FK506都有严重损害肾功能等副作用,为研究中药在这方面应用的可能性,我们采用新型的免疫抑制剂雷帕霉素(RAPA)与中药百令胶囊联合应用,以观察其对大鼠小肠移植后细胞凋亡和凋亡基因FasL mRNA表达的影响。

1 材料与方法

1.1实验动物与分组 实验大鼠选用健康成年雄性Wistar和SD大鼠(北京医科大学实验动物部供给),体重200~300g,根据不同处理随机分为5组,每组24只大鼠。1组:假手术对照组;2组:排斥组,wistar→SD行异位小肠移植模型组;3组:RAPA2mg/kg组;4组:RAPA4mg/kg组;5组:RAPA2mg/kg加中药百令胶囊1g/kg组。3、4、5组根据要求术后0~7d经口灌服药物。

1.2实验步骤

1.2.1各组移植大鼠分别于术后1、3、5、7d处死,取移植小肠标本,-80℃低温冰箱保存,对冰冻移植小肠标本采用细胞凋亡检测试剂盒,用TUNEL方法标记,过氧化物酶法显色。每张切片随机选取5个高倍视野取细胞凋亡数量计算平均值。采用F检测。

1.2.2对冰冻移植小肠标本采用逆转录半定量多聚酶链式反应(QRTPCR)方法检测大鼠移植小肠组织中FasL mRNA表达水平。采用F检验、q检验。

1.2.3主要试剂 ①变性缓冲液:TRIzol试剂盒;②RNA酶抑制剂;③寡聚3’端引物:Oligod(T)12-18;④逆转录酶药盒:MMLV、DTT;⑤PCR药盒:TaqDNA聚合酶,10×反应缓冲液,氯化镁⑥PCR扩增引物:FasL引物来源于参考文献,由上海申工合成。βactin引物序列由北京人民医院提供。

1.2.4细胞总RNA抽提及逆转录 以异硫氰酸胍法提取细胞总RNA。取2μlRNA,加入Oligod(T)12-18引物2μl,RNasin1μl,DTT1μl,5×逆转录酶缓冲液4μl,4×dNTP8μl,MMLV逆转录酶2μl,总反应体积20μl,37℃反应2h,95℃水浴5min灭活逆转录酶,并迅速冷却,以DEPC水稀释至20μl,-20℃冰箱保存。

FasL分子cDNA引物

上游引物5’GGAATGGGAAGACACATATGGAACTGC-3’

下游引物5’CATATCTGGCCAGTAGTGCAGTAATTC-3’PCR扩增237bp产物

βactin分子cDNA引物

上游引物5’ATCATGTTTGAGACCTTCAACA-3’

下游引物5’CATCTCTTGCTCGAAGTCCA-3’PCR扩增318bp产物,总反应体积10μl,预变性94℃2min

变性:94℃5s,退火:48℃5s,延伸:72℃15s,后延伸:72℃2min,共30次循环。取PCR产物10μl在2%琼脂糖凝胶上进行水平电泳,电压2V/cm,电泳时间15h。计算机凝胶图像分析系统定量,将各组密度扫描数值分别除以同组βactin的数值,所得比值作为评价mRNA表达量的一个有效指标。数据采用t检验或F检验,q检验分析处理。

1.3实验药物:RAPA由美国Sigma公司提供。百令胶囊是用专利方法分离的冬虫夏草菌种经生物工程方法精制而成的纯中药制剂。

2 结果

2.1细胞凋亡检测结果 术后1d,各组小肠组织中存在少量凋亡细胞,且凋亡细胞数目各组间无显著性差异。术后1组小肠组织中细胞凋亡数量逐渐减少,其它组小肠的细胞凋亡数量逐渐增多,特别是2组术后3、5、7d测定值和3组术后5、7d测定值与本组前一时点测定值比较均有显著性差异。除各组术后1d,1、4组间术后3d测定值比较无显著性差异、5组术后7d与4组相比无显著性差异外,同期各组间术后3、5、7d小肠组织的凋亡细胞数目均有显著性差异(见表1)。

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2.2移植小肠排斥反应强度与细胞凋亡的关系 不典型排斥反应、Ⅰ度排斥反应和Ⅱ度排斥反应等不同排斥反应强度间的细胞凋亡数量具有显著性差异。

2.3各组大鼠小肠移植术后凋亡基因FasL mRNA表达情况 术后1d移植小肠中FasL mRNA表达水平各组无显著性差异;术后3d移植小肠FasL mRNA表达水平,排斥组与1、3、4组相比有显著性差异P<005;术后5d移植小肠中FasL mRNA表达水平,排斥组与1、4、5组相比有显著性差异P<005;术后7d排斥组移植小肠FasL与1、4组相比有显著性差异P<005,5组与1、4组相比有显著性差异P<0.05,见表2。

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3 讨论

细胞凋亡在小肠移植中起重要作用,人类小肠移植急性排斥的病理学特征包括单核细胞浸润和隐窝细胞凋亡细胞数量增加,晚期出现粘膜溃汤。因此细胞凋亡是小肠移植排斥反应一个必要的病理学特征。Fayyazi研究大鼠小肠移植排斥反应与细胞凋亡的关系,发现异系移植组出现大量肠上皮细胞凋亡,而同系移植组未出现此现象,移植排斥反应与细胞凋亡密切相关,凋亡的程度是诊断和预后排斥反应的另一种可信的标志物。

本研究发现,移植组的小肠组织细胞凋亡数量呈增多趋势,特别是在病理证实出现排斥反应前期和出现排斥反应时,移植小肠组织中细胞凋亡的数量显著增加。排斥反应中出现大量细胞凋亡可能与移植物浸润淋巴细胞有关,不同程度的排斥反应间移植小肠组织细胞凋亡数量具有显著差异,说明细胞凋亡应成为移植物被排斥的重要指标。作为细胞死亡的不同形式,细胞坏死和细胞凋亡都是排斥反应的病理结果,且后者的发生时间明显早于前者,排斥组细胞凋亡数量在术后3d即开始较前一检测时点测定值显著升高。因此,细胞凋亡数量明显增多可作为预报小肠移植排斥反应另一种可信的标志物。

本实验还表明,观察期间内予实验大鼠以RA2PA4mg/(kg·d)可完全抑制排斥反应的发生,而RA2PA2mg/(kg·d)只能延缓排斥反应的发生时间,不能完全抑制排斥反应;RAPA4mg/(kg·d)可显著抑制肠细胞凋亡的发生,与排斥组相比有显著性差异,而RAPA2mg/(kg·d)与中药百令胶囊1mg/(kg·d)联合应用于术后7d抑制凋亡的能力与4mg/(kg·d)RAPA组无显著性差异,说明两者联合应用具有相加或协同作用。

Kageyama在大鼠心脏移植模型中发现Fas在同系移植和异系移植组都持续表达,排斥发生时,FasL、GranzymeB和穿孔素表达上升,说明穿孔素/granzymeB途径和Fas/FasL途径都参与了大鼠心脏移植排斥反应。Josien在大鼠异位心脏移植模型中发现FasL仅在排斥组中表达,表达量增加了10倍。Sharma发现在人类急性肾移植排斥反应中FasL mRNA表达增加,而慢性排斥反应中未发现。排斥反应的组织学严重程度与移植物内FasL、Fas、GranzymeB和穿孔素mRNA的表达呈正相关,而Fas在同系和异系移植组都持续表达。

本实验证实,各组大鼠移植术后1d,都表达少量的FasL,各组FasL mRNA的表达无显著性差异,而排斥组术后3、5、7dFasL mRNA表达升高。与对照组相比有显著性差异P<0105,但排斥组间3、5、7d相比无差异,与细胞凋亡的数量无明显的相关性,与排斥反应的分级和严重程度也无明显的相关性,推测可能还有其它的凋亡基因参与了凋亡的反应过程,如穿孔素/granzymeB途径。

本研究还发现RAPA4mg/kg组术后3、5、7dFasLmRNA表达与假手术对照组相比无显著性差异,与同期排斥组相比均有显著性差异P<0105,说明RAPA4mg/kg组既能完全抑制排斥反应,也能抑制凋亡及凋亡基因FasL mRNA表达,推测其作用机制之一是通过调节凋亡基因FasLmRNA表达,抑制肠上皮细胞的凋亡,而发挥其免疫抑制、抗排斥反应的功能。术后7d,RAPA2mg/kg加百令胶囊组抑制凋亡的能力与RAPA4mg/kg无差异,但对凋亡基因FasL mRNA表达方面两组之间有显著性差异,说明两者联合应用抗排斥和抗凋亡的协同作用与FasL mRNA表达无关,可能其它的因素参与其中的反应过程。

冬虫夏草为麦角菌科的一种药用真菌,人工虫草可对小鼠胸腺产生明显抑制作用,日本学者从冬虫夏草中分离出的免疫抑制物质ISP21具有完全不同于已知免疫抑制剂的作用机理,ISP21阻碍IL22受体以下的途径,即以丝氨酸为基质的丝氨酸棕榈酰转移酶,ISP21抑制该酶的反应而抑制了细胞增殖。因此对中药冬虫夏草进行提纯并找出其确切的分子成分,进而人工合成,则可望开发出活性高、副作用小的免疫抑制剂,这对于器官移植领域具有重要的社会和经济意义。

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